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暗场显微成像技术（DFM）和表面增强的拉曼光谱（SERS）和新兴的分析技术, 已广泛应用于化学检测和生物传感的快速诊断分析。近期，卓立汉光集团拜访合肥工业大学食品与生物工程学院刘洪林教授课题组，课题组基于DFM和SERS这两个关键技术在猕猴桃软腐病致病菌属鉴定方面开展了相关研究工作。
该研究成果以“Early warning of Diaporthe infection in kiwifruit soft rot by plasmonic dimer-enhanced Raman spectroscopy”为题发表在Iscience期刊中。
猕猴桃（Kiwifruit）富含充足的维生素C，具有抗氧化特性，受到广泛关注。然而，其易受真菌病原体的侵害，在生长和储存阶段导致软腐病，致使严重经济损失。拟茎点霉菌属是一种常见的软腐病致病菌属。迄今为止，对这类致病菌的研究较少，亟需开发一种方便、快速、敏感的早期预警或诊断方法。
近日，研究团队筛选了一对致病菌属水平的特异性引物，并基于此基础开发了一种超灵敏的SERS检测方法，用于早期猕猴桃中拟茎点霉菌属的特异性检测。采用RGBtoHSI算法辅助DFM成像实验调节引物修饰密度，促进靶点诱导的金颗粒二聚化形成，在感染24h后即可实现阳性报告。与传统PCR法相比，该新型SERS方法对拟茎点霉菌属具有良好的特异性和超敏感性，为猕猴桃软腐病病原菌感染的早期预警提供了良好的检测技术手段。
图1. 拟茎点霉菌属的引物筛选
从NCBI GenBank数据库中获得靶点目的基因核苷酸序列，通过DNAMAN比对确定拟茎点霉菌属的保守区和可变区，用于引物设计。研究团队设计了一条检测引物(P1)；一条兼并引物(P2)。特异性引物可以从四株拟茎点霉菌属中扩增出一条清晰的条带，而其他属的12种真菌在相同条件下没有扩增，证实了引物的特异性。
图2. 拟茎点霉菌属引物协助金颗粒二聚化助力等离子体SERS和DFM信号的增强
P1和P2两个引物探针可以与目标物互补配对，锚定在金颗粒表面形成等离子体纳米探针。利用P1和P2两个引物探针缩短目标片段的长度，目标链在退火过程中与引物探针杂交形成Y型双链，促使金颗粒二聚化，便于后续DFM成像和SERS检测。
图3. DFM表征金颗粒二聚化组装过程
为了提高分类和定量分析的准确性，研究团队首先利用DFM优化了修饰在金颗粒表面引物探针的浓度，其原理主要是不同的等离子体纳米探针聚集状态在DFM下显示出不同的颜色。由于局域表面等离子体共振耦合效应，绿点和黄点代表金颗粒单个纳米探针和金颗粒二聚体，橙点和红点则是更大的成簇聚集体。研究团队发现在引物探针比例合适的条件下，待检目标物诱导的聚集更倾向于金颗粒二聚体而不是大的成簇聚集体，即DFM观察到的黄点较多，红点较少。随后采用RGBtoHSI算法对DFM成像纳米探针的簇类型进行区分和统计。根据分类的结果，用小矩形重新绘制斑点，绘制图像与原始DFM图像一致，说明了算法的可行性。
图5. 植物病原菌基因组DNA的双盲检测
接下来，研究团队利用SERS探究金颗粒二聚体组装过程。1326 cm−1波长处SERS信号的增强，表明随着待测目标浓度的增加，金颗粒二聚体增加，该结果与上述DFM成像的纳米探针聚集状态相匹配。提取猕猴桃软腐病十八种已知病原体的基因组DNA进行双盲测试，检测结果与预先标记一致，表明SERS检测在实际应用中基因组DNA进行分析的特异性和可行性。
图6. 真正感染猕猴桃软腐病的预警
最后，研究人员探究了SERS方法检测病原体感染猕猴桃的适用性和敏感性。收集不同时间点的感染组织，提取基因组DNA，进行SERS检测。与PCR法相比较，感染24 h后，感染组产生的SERS信号明显高于对照组。这些结果都表明SERS检测法比PCR法更敏感，可以在没有明显症状的情况下诊断患病的猕猴桃，更适合用于猕猴桃软腐病感染的早期预警。
猕猴桃软腐病致病菌属鉴定实验手册流程图
此外，研究团队还凝练了猕猴桃软腐病致病菌属鉴定实验手册。该实验手册中详细介绍了如何筛选拟茎点霉菌属的保守区域，并设计合适的纳米探针。传统的检测方法，例如基于病原体特征的表观分析，病理检测和聚合酶链反应(PCR)方法，它们要么耗时长，要么灵敏度低，不适合实际的应用。通过DFM对不同金颗粒聚集状态进行分类；利用SERS对样品进行检测具有方便、快速和灵敏度高的优势。首先，利用MEGA7筛选拟茎点霉菌属的保守序列，设计引物互补序列构建纳米探针；随后， 利用DFM技术分别对金颗粒的聚集状态进行分类和信号观察。同时，利用Fiji-ImageJ 2软件代码转换实现DFM图像的批量处理。最后，利用便携式拉曼光谱仪实现了对拟茎点霉菌属不同种属的快速检测。
综上所述，一方面，基于DFM技术研究团队开发了一种无“系绳”连接的单分子偶极与单个金颗粒之间的PRET纳米尺模型，在活细胞受体蛋白分子水平上测量了位点间分离距离和蛋白质互作。该新型纳米尺具有抗自淬灭和光漂白的稳定性，在观察单分子事件方面具有独特的优势，为纳米尺度距离测量增添了新的替代工具，在未来食品与生物工程领域的生物标志物检测和靶标鉴定方面具有重要的科学意义。另一方面，基于DFM和SRES技术，开发了一种等离子体二聚化SERS检测方法，能够在猕猴桃感染软腐病的早期24小时内检出致病菌。通过DFM和RGBtoHSI算法辅助优化了引物探针的比例，提高了SERS检测的灵敏度。在猕猴桃病原体感染早期预警和现场管理决策方面具有较大的应用前景。
合肥工业大学刘洪林课题组简介
刘洪林，博士，教授，博士生导师，黄山学者，国家优秀青年科学基金获得者，国家重点研发计划项目首席科学家。入选合肥市高层次人才、安徽省级领军人才。获得中国科学技术大学理学学士和工学博士学位。主要从事食品安全领域的化学与生物传感分析、食品质量安全评价与监控技术研究。
已主持国家重点研发计划、国家优秀青年科学基金、省重点研发计划等项目10余项。已在Nature Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Anal. Chem.、Food Chem.、LWT等杂志发表论文50余篇，入选全球Top 1%“ESI”高引论文，获得安徽省自然科学论文一等奖、安徽省自然科学奖一等奖等奖励。
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