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暗場顯微成像技術（DFM）和表面增強的拉曼光譜（SERS）等新興的分析技術, 已廣泛應用于化學檢測和生物傳感的快速診斷分析。近期，卓立漢光集團拜訪合肥工業大學食品與生物工程學院劉洪林教授課題組，課題組基于DFM和SERS這兩個關鍵技術，在開發活細胞膜表面納米尺和獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定方面開展了相關研究工作。
首先為大家帶來劉教授團隊有關細胞膜表面納米尺相關研究工作，該研究成果以“Plasmon Resonance Energy Transfer Nanoruler for Pinpointing Molecular Distance and Interaction on the Living Cell Membrane”為題發表在Nano letters 期刊中（doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c01629）。
近年來，光學納米尺的應用越來越廣泛，如Förster共振能轉移 (FRET) 和納米金屬表面能轉移(NSET) 等是常用的光學納米尺。其中FRET具有良好的準確性，但其測量范圍往往被限制在10 nm以內；NSET克服了10 nm的限制，具有較長的檢測量程，但其在r0的確定和測量存在挑戰。此外，依賴于熒光檢測的傳統納米尺不可避免的存在自猝滅和光漂白等不穩定性。因此，開發可靠、有效的方法以提高納米尺的穩定性和準確性，特別是在活細胞體系中，一直是令人著迷但富有挑戰性的課題。PRET是發生在供體納米金屬表面和受體分子間的非輻射能量轉移過程，等離子體金屬表面與共振分子偶極間的相互作用導致能量傳遞，這一過程可以通過高信噪比、穩定性和靈敏度的暗場顯微鏡觀察。
近日，課題組報道了單個納米金顆粒和單個分子偶極之間的PRET現象。研究團隊使用兩種無競爭性結合的配體，即適體XQ-2d-Cy3和抗體antiCD71，識別活細胞膜上同一受體蛋白CD71的不同位點；適體攜帶小分子熒光標簽作為能量受體，抗體攜帶單粒徑的金顆粒作為供體，觀察到了能量供體與受體之間無任何“系繩”連接的PRET現象。基于此原理，構筑了靈活的PRET光學納米尺，實現了活細胞表面分子距離和蛋白互作的觀察與測量。有限元理論模擬和暗場成像實驗結果一致表明，該PRET納米尺在活細胞膜表面測量位點分離距離和蛋白互作具有可行性和穩定性，在分析科學納米尺度測量領域具有廣泛的應用前景。
圖 1. PRET納米尺的理論可行性和探針表征
理論上，研究團隊通過有限元分子動力學模擬了單個金顆粒和單分子偶極之間的PRET過程。金顆粒具有強烈且連續的電場強度分布，單分子偶極的引入顯著降低了電場強度，且表現出明顯的距離依賴性。特別是兩者分離距離r小于5 nm時，單個金顆粒和單分子偶極之間存在顯著的PRET能量轉移。根據非輻射能量躍遷機制，PRET能量損失可歸因于共振受體和溶液介質通過偶極-偶極相互作用的非輻射能量傳遞。理論結果支持了單個金顆粒和單分子偶極之間PRET效應的可行性。
圖2. 活細胞膜上暗場顯微鏡原位觀察PRET過程
實驗上， 研究團隊利用暗場顯微鏡在活細胞膜表面原位觀察了PRET過程，該暗場散射光譜數據采用北京卓立漢光儀器有限公司的RTS系列暗場顯微光譜系統檢測。一方面，依據距離依賴的淬滅效率經驗公式，計算得到PRET能量轉移效率為30±7%，進一步得到兩個配體識別位點（適體XQ-2d-Cy3和抗體antiCD71）之間的分離距離為16.3±1.5 nm；另一方面根據有限元模擬結果可以推導出兩識別位點間距離范圍為13.0-18.0 nm。證明了該PRET納米尺具有一定的準確性、穩定性。
圖3. 活細胞膜上流式細胞術原位觀察NSET過程
此外，研究團隊還利用流式細胞術在活細胞膜表面觀察了同一系統中 與PRET相反的能量轉移過程——NSET現象。即單獨激發熒光標簽（XQ-2d-Cy3）時，可以反向觀察到XQ-2d-Cy3到金顆粒表面的能量轉移過程。
圖4. PRET納米尺測量活細胞膜表面分子距離和相互作用
轉鐵蛋白Tf與適體XQ-2d-Cy3之間的競爭性結合，抑制了適體的結合，使得活細胞膜表面降低的金顆粒散射信號有所恢復，進一步驗證了PRET能量轉移過程的發生，展現了該PRET納米尺測量分子分離距離、蛋白質互作、分子靶標識別等方面的可行性。
合肥工業大學劉洪林課題組簡介
劉洪林，博士，教授，博士生導師，黃山學者，國家優秀青年科學基金獲得者，國家重點研發計劃項目首席科學家。入選合肥市高層次人才、安徽省級領軍人才。獲得中國科學技術大學理學學士和工學博士學位。主要從事食品安全領域的化學與生物傳感分析、食品質量安全評價與監控技術研究。
已主持國家重點研發計劃、國家優秀青年科學基金、省重點研發計劃等項目10余項。已在Nature Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Anal. Chem.、Food Chem.、LWT等雜志發表論文50余篇，入選全球Top 1%“ESI”高引論文，獲得安徽省自然科學論文一等獎、安徽省自然科學獎一等獎等獎勵。
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本研究暗場散射光譜數據采用的是我司RTS系列暗場顯微光譜系統檢測測，該系列已升級為RTS2-Omni-Imager 暗場散射顯微高光譜儀。如需了解產品，歡迎咨詢。
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